Llama-Derived Single Domain Antibodies to Build Multivalent, Superpotent

青龙偃月刀

Llama-Derived Single Domain Antibodies to BuildMultivalent, Superpotent and Broadened NeutralizingAnti-Viral Molecules

青龙偃月刀

同时能识别多价病毒表位的抗体能有效阻止病毒感染和产生交叉保护力。
利用噬菌体展示技术从羊驼免疫文库中筛选出抗呼吸道合胞病毒(融合蛋白)、狂犬病病毒(糖蛋白)和H5N1流感病毒(血凝素5)三聚包膜蛋白的重链抗体片段(VHH)。
病毒中和试验证实VHH均能识别不同的受体结合位点，亲和力在低摩尔水平。
VHH通过不同长度的linker进行连接融合，构建多聚体结构，对RSV的中和能力提高了4000倍，对狂犬病毒的中和能力提高了1500倍，对流感H5N1的中和能力提高了75倍。
通过多价(两个或三个相同的VHH)和双侧异位(两个不同的VHH)结构，三种病毒对不同病毒株的交叉保护能力也得到了提高。

青龙偃月刀

By combining a VHH neutralizing RSV subtype A, but not subtype B with a poorly neutralizing VHH with high affinity for subtype B, a biparatopic construct was made with low nanomolar neutralizing potency against both subtypes. Trivalent anti-H5N1 VHH neutralized both Influenza H5N1 clade1 and 2 in a pseudotype assay and was very potent in neutralizing the NIBRG-14 Influenza H5N1 strain with IC50 of 9 picomolar. Bivalent and biparatopic constructs against Rabies virus cross neutralized both 10 different Genotype 1 strains and Genotype 5. The results show that multimerization of VHH fragments targeting multiple epitopes on a viral trimeric spike protein is a powerful tool for anti-viral therapy to achieve ‘‘best-in-class’’ and broader neutralization capacity.

青龙偃月刀

2009年，H1N1流感病毒大流行。RNA病毒的基因组容易发生变异，很难通过预防或抗病毒治疗来控制。
对高度保守的表位产生中和性免疫反应的疫苗对病毒才能有效。
一些非常有效的抗病毒化合物已经被开发用于治疗例如艾滋病毒、乙型肝炎和流感感染，但它们的使用之后很快出现了药物诱导的逃避突变体。

青龙偃月刀

对于许多包膜病毒来说，进入靶细胞依赖于病毒与细胞膜的融合，由病毒糖蛋白与靶细胞膜的相互作用驱动的。
本研究对呼吸道合胞病毒(RSV)融合蛋白(F蛋白)、H5N1禽流感H5血凝素和狂犬病糖蛋白(G蛋白)3种不同的负链RNA病毒进行了评价。RSV是婴幼儿下呼吸道感染和住院的主要原因，单克隆抗体Synagis的预防性治疗仅限于早产儿或患有心脏或肺部疾病的婴儿。
H5N1型流感(禽流感)具有高致病性和毒性，可由家禽传播给人类，引起可能致命的病毒性肺炎。目前还没有治愈方法，但正在研制疫苗和中和抗体。
狂犬病也是一种从动物传播到人类的病毒，如果在病毒感染大脑之前没有采取预防措施，就会导致致命的急性脑炎。这三种病毒都会导致严重的人类感染，尽管可以获得狂犬病和RSV的中和抗体，但仍需要替代和改进抗病毒治疗。

青龙偃月刀

驼类产生的单域VHHs已被证明是强大的病毒中和剂。VHH的单链性质允许使用相同或不同的VHH构建块构建和生产多聚体分子。
单域分子(Single domain molecules, VHH)是重链抗体结合抗原的可变部分。
在这项研究中，我们证明了VHH的格式灵活性允许产生具有低皮摩尔中和力的抗病毒分子，比单价VHH亲和力好4000倍，并拓宽了中和活性，可能克服了病毒逃脱中和的机会。还有一种改进是通过融合识别不同表位的VHH，以及融合多拷贝的同一VHH来实现。

青龙偃月刀

免疫原为：
RSV的三聚体RSV(Long strain, subgroup A), F蛋白，70Kda。H5N1 (H5, A/Vietnam/1203/2004) 血凝素蛋白三聚体，免疫用量是前两次免疫用40微克，后四次免疫用20微克。
这两种蛋白免疫6周后加强免疫，第7周免疫时取血150ml。
灭活的狂犬病毒疫苗一共免疫5次，周期为57天。筛选用抗原为PV (Pasteur)病毒株G蛋白。
常规方法建库，库的容量为10^8
SynagisH (PalivizuMab, MedImmune Inc., 人源化的单抗IgG1k抗体）用于竞争性洗脱抗RSV F蛋白的单域抗体。
狂犬特异性鼠单抗IgG2a 8-2 (EBL-1，基因5型) 用于竞争性洗脱抗狂犬病毒G蛋白的单域抗体。

青龙偃月刀

分离病毒刺突蛋白的单域抗体：
进行了两轮筛选，筛选到188个克隆，其中149个能识别RSV。94个克隆能识别狂犬病毒G蛋白，56个克隆能识别H5血凝素蛋白。
筛选到的克隆分别和Synagis，mAb 8-2或者是流感病毒的唾液酸进行竞争ELISA实验。
最终，构建了抗RSV的3个双价纳米抗体和4个双特异抗体。抗H5N1的4个双价纳米抗体，两个三价抗体。抗狂犬病毒的四个双价抗体和四个双特异抗体。
构建抗体用的linker长度约9-35aa。纯化后的抗体浓度能达到0.5-1mg和单价单域抗体相比较，产量提高了3-10倍。

青龙偃月刀

ELISA结合实验
ELISA板上分别包被三种蛋白，加周质提取物或者纯化后的纳米抗体作为一抗，加兔抗骆驼的抗体作为二抗，或者加鼠抗-MYC作为二抗，加HRP-的抗鼠或抗兔抗体，OPD或者TMB显色。

青龙偃月刀

竞争性ELISA实验：
① RSV F包被ELISA板，抗原用PBS稀释，每孔加入200ng，包被过夜，第二天用PBS稀释的4%脱脂奶或者2%BSA封闭。
一抗加10-20ul的VHH周质液或者纯化的VHH抗体加0.67 nM Synagis Mab, 3 nM Synagis Fab(HA-标签) 或者3 nM 101F Fab (HA标签)
二抗加HRP-标记的山羊抗人FC，鼠源抗-HA抗体加HRP-兔抗鼠抗体。
② 取自胎牛血清的胎蛋白，抗原用PBS稀释，每孔用量为10 ug，包被过夜。加100 ng/ml生物素化标记的H5 A/Vietnam/1194/04 ，加入10-20ul的VHH周质液或者纯化的VHH抗体，加入1/5,000稀释的HRP标记的链霉素。
③ 狂犬病毒G蛋白包被ELISA板，包被过夜，封闭，加4nM 鼠IgG2a单抗8-2和10-20ul的VHH周质液，或者纯化的VHH抗体。二抗为HRP标记的驴抗鼠抗体
OPD或则TMB显色。