High-throughput isolation of immunoglobulin genes from single human B cells

青花瓷

High-throughput isolation of immunoglobulin genes from singlehuman B cells and expression as monoclonal antibodies

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单B细胞抗体制备技术能够对单个的抗原特异性B 细胞进行抗体基因的体外克隆和表达，保证了轻重链可变区的天然配对，相较于传统的抗体制备技术，具有基因多样性好、效率高、全人源、需要的细胞量少等优势。

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人杂交瘤技术是将免疫过的人或鼠 B 细胞与人骨髓瘤细胞融合从而获得无限传代且能分泌抗体的杂交融合细胞，该技术受到很多局限，如人骨髓瘤细胞系非常有限、细胞融合成功率低且容易造成染色体丢失等。针对于以上缺陷，利用 EB 病毒 (Epstein-Barr Virus，EBV) 在体外能感染正常静止的 B 细胞，使它们变成永生化的淋巴细胞系这一特性，将EBV 转化B 细胞制备人杂交瘤细胞，但是这种细胞不是恶性肿瘤细胞，较难克隆且抗体产量低。

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单B细胞分离可分随机分离和抗原特异性分离：

随机分离B细胞，操作简单，适用于抗原特异性抗体浓度较高的血样，通常来自于疫苗接种者或患者。
分离抗原特异性 B 细胞，操作较复杂，尤其适合抗肿瘤抗体、自身免疫抗体等特异性抗体含量较低的情况。

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单抗对于研究感染性疾病的致病性，感染病原的蛋白结构，及相关的保护性免疫，并对进行被动免疫疗法和诊断至关重要。针对病毒抗原的人类B细胞库对于设计能诱导产生广泛的保护性抗体反应的疫苗很重要，如HIV-1和流感。
传统的产生人源性单克隆抗体方法有噬菌体展示技术，EB病毒(EBV)转化人B细胞克隆等技术，比较耗时。

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将单抗的重链和轻链分别插入真核表达载体中。真核表达载体需要包括CMV启动子，Ig的先导序列，重链和轻链的恒定区序列，poly(A)信号序列。

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2F5单抗是抗HIV-gp41抗体。 用做阳性对照。抗体轻重链的氨基酸序列为(PDBID:1TJG:H and 1TJG) ，核苷酸序列为 (Kunert et al., 1998).
将2F5的轻重链可变区基因插入到真核表达载体中构建一对真核表达载体HV13221和HV13501。
双质粒共转染293T细胞后，得到稳定表达2F5抗体的细胞系。
人B细胞系G8，能稳定表达一个etes antibody recognizing the HIV-1 gp41 immunodominant epitope,was generated by EBV-transformation of B cells in terminal ileum biopsy obtained from anacute/early HIV-1 positive subject (Hwang, unpublished). An EBV-transformed human B cellline, 7B2, that produces an anti-HIV-1 gp41 antibody (Binley et al., 2000) was kindly providedby James Robinson. G8 and 7B2 cell lines were grown in Hybridoma-SFM (Invitrogen,Carlsbad, CA). mAbs were purified from culture supernatants using a ProPur Protein G column(NuNC, Rochester, NY).

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流感疫苗(Fluzone)接种后的志愿者，取血，分离第0天，7天和21天血样中的淋巴细胞。淋巴细胞用含有20%FCS和7.5%DMSO的RPMI培养基重悬，冻存在液氮中。
流式分选用抗体有：
PE标记的抗人IgG, CD3 PE-Cy5, CD16 PE-Cy5, CD19 APC-Cy7, CD20 PE-Cy7, CD27 Pacific Blue, CD235a PE-Cy5,IgD PE, IgM FITC (BD Biosciences, San Jose, CA), CD14 PE-Cy5 and CD38 APC-Cy5.5(Invitrogen, Carlsbad, CA)。96孔板中加入20ul的RT反应缓冲液，包括5 μl的5× First strand cDNA缓冲液, 0.5 μl of RNAseOut, 1.25 μl DTT, 0.0625 μl Igepal，13.25 μl水，使用前-80℃保存。
设门CD3-/CD14-/CD16-/CD235a-/CD19+/CD20low-neg/CD27hi/CD38hi ，分选出细胞接到96孔PCR板中。

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不同荧光标记在不同的仪器上强度不同。
FACS Calibur仪器为例：PE >APC >PE-Cy5 >PerCP >FITC >PerCP-Cy5.5，
通常来说，PE最强，适用于弱表达抗原。FITC强度较弱，适用于强表达抗原，使用范围比较广。
流式抗体每个通道只能选择1种荧光素。各个通道之间的荧光素可以随意搭配。
切忌所有指标选择同一个通道的荧光标记，以防止荧光的重叠和相互干扰，影响最后结果。
流式细胞仪的通道越多，同一份样本能同时做的表面/胞内标志就越多。常用荧光标记包括FITC, PE, PEcy5, PEcy5.5, APC等。

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反转录反应体系中加入50单位的Superscript III反转录酶，0.5uM的反转录引物混合物，37°C 作用1小时。获得cDNA第一链后，通过两轮PCR分别扩增出VH, Vκ和Vλ基因。
第一轮PCR反应体系为50ul，5 μL RT反应产物，5单位的 HotStar Taq Plus，0.2 mM dNTPs，0.5 μM引物混合物。
95°C × 5分钟
95°C × 30 sec, 55°C (VH and Vκ) 或者 50°C (Vλ) × 60 sec, 72°C × 90sec, 一共35个循环。
72°C × 7 min。
第二轮PCR反应体系为50ul，2.5 μL第一轮PCR的反应产物，5单位的 HotStar Taq Plus，0.2 mM dNTPs，0.5 μM引物混合物。
95°C × 5分钟
95°C × 30 sec, 58°C (VH), 60°C (Vκ) or 64°C (Vλ) × 60 sec, 72°C × 90sec, 一共35个循环。
72°C × 7 min。
骨髓RN样品作为阳性对照，二轮PCR中所用引物在5’端含有tag标签，用于后续融合成线性表达框。
抗体序列用http://imgt.cines.fr/进行分析。