Vibrio fluvialis 河弧菌LPS的纳米抗体

青花瓷

01034
南昌大学
河流弧菌是海洋中一种常见的条件致病菌，属于弧菌属，是弧菌属中仅次于霍乱弧菌和副溶血弧菌的食源性致病菌。
一种嗜盐的革兰氏阴性兼性厌氧细菌，广泛分布于海水和稍带盐分的港湾水中。
河弧菌可产生类肠毒素、细胞毒素、金属蛋白酶和溶血素等多种与致病有关的毒力因子，可引起人类河弧菌肠炎。
在全球范围内已引起大规模的腹泻散发与爆发流行，尤其在卫生条件较为落后的发展中国家。
建立对河弧菌血清学的快速分型方法对于实现河弧菌的快速检测具有重要的意义。

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脂多糖分子从内而外分别由类脂 A、核心多糖和O-多糖侧链组成，其中 O-多糖侧链是一种特异性 O-抗原。
类脂 A 和核心多糖结构相当保守，而 O-抗原是脂多糖分子中最易发生变异的部分，在不同类群、甚至同一类群不同菌株之间，或者同一菌株不同血清分型之间都有差异。
河弧菌脂多糖结构中的 O-抗原结构的不同是构成其血清分型不同的主要原因。
多糖结构内部的 O-多糖侧链是一种特异性较强的 O-抗原，该抗原常被用来作为标靶物质进行研究，它也是被用来区分某些细菌血清分型的重要依据。

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河弧菌是一种嗜盐的革兰氏阴性兼性厌氧细菌，它在无盐培养基上一般不能生长或生长不良。
仅当盐分含量达到 1%-6%甚至 8% NaCl 时，河弧菌才能生长良好。

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河弧菌可引起霍乱样腹泻，其检测方法目前主要是依据其生化性状。
目前河弧菌的检测方法主要有传统的选择性鉴别培养基、噬菌体诊断技术、免疫PCR 技术、荧光抗体技术等。

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灭活菌液抗原的液相淘选
1. 取血清分型为A的河弧菌灭活菌液100 μL置于1.5 mL离心管（第1管）中，加入100 μL的天然噬菌体纳米抗体库， 37 ℃孵育1 h。
2. 12000 rpm，离心1 min，用移液枪将上清吸入至另一支1.5 mL离心管(第2管)中。
3. 取100 μL的0.5% PBST加入至第1管中，用漩涡振荡仪重悬沉淀， 12000 rpm离心1 min，用移液器移出上清液加入到上一步骤中的第2管中。
4. 再取1 mL的0.5% PBST重悬沉淀， 12000 rpm，离心1 min，弃上清液。重复该操作10次。
5. 再用1 mL 1×PBS重悬沉淀， 12000 rpm，离心1 min，弃上清液。重复该操作10次。
6 取 100 μL 的 Gly-HCl (pH=2.2)重悬沉淀，用带有滤芯的移液枪头反复吹吸几次， 12000 rpm 离心 1 min，取上清。
7 将上一步骤得到的上清与 15 μL 中和缓冲液 Tris-HCl (pH=8.6)混匀，从中取出 10 μL 进行洗脱噬菌体滴度的测定，剩余洗脱液用于扩增噬菌体以用来进行下一轮淘选。

对第二管中噬菌体进行操作：
8 取血清分型为B的河弧菌菌液 100 μL 与步骤3 中的B 管中液体混匀，37 ℃，孵育 1 h。
9 12000 rpm，离心1 min，用移液枪将上清吸入至另一支1.5 mL离心管（第三管）中。
10 取 100 μL 的 0.5% PBST 重悬沉淀， 12000 rpm，离心 1 min，用移液器移出上清液加入到上一步骤中的 第三管中。
11 重复上述步骤 4~7。

对第三管中的噬菌体进行操作：
12 取血清分型为 C的河弧菌菌液 100 μL 与步骤 10 中的第三管中液体混匀，37 ℃，孵育 1 h。
13 12000 rpm，离心1 min，用移液枪将上清吸入至另一支1.5 mL离心管（第四管）中。
14 取 100 μL 0.5% PBST 重悬沉淀， 12000 rpm 离心 1 min，用移液器移出上清液加入到上一步骤中的第四管中。
15 重复上述步骤 4~7。

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3轮常规淘选，每轮淘选条件逐渐趋于严格，PBST浓度逐渐增加，清洗次数加大，去除结合性低的噬菌体；
洗脱下来的噬菌体滴度出现逐轮增加的现象，出现富集。
第3轮的噬菌体富集度却出现了下降趋势，提示与河弧菌结合的噬菌体富集达到了较高程度（这个解释挺有意思）。

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洗脱噬菌体的扩增与纯化
1. 从淘选得到的噬菌体中移取10 μL进行滴度测定后，剩余噬菌体加入5 mL大肠杆菌TG1培养物中（OD=0.35~0.5）。
2. 37 ℃，静置15 min；再放置于37 ℃摇床， 220 rpm，振荡培养约30~45 min。
3. 将培养物加入20 mL的2×YT-A液体培养基中， 37 ℃， 220 rpm，振荡培养时间大约3~5 h。
4. 往培养物中加入辅助噬菌体M13K07（M13K07工作浓度为1:1000，即稀释1000倍， v/v），将其混匀。
5. 37 ℃，静置15 min；再放置于37 ℃摇床， 220 rpm，振荡培养约30~45 min。
6. 4 ℃， 1000 g，离心10 min，弃上清。
7. 用25 mL的2×YT-AK液体培养基重悬沉淀，再放置于30 ℃摇床， 220 rpm，震荡培养6~8 h。
8. 4 ℃， 8000 rpm，离心10 min，取上清。
9. 向上一步骤得到的上清中加入1/5体积（v/v）的PEG-NaCl溶液，且于4 ℃放置冰上进行冰浴，沉淀噬菌体大约3~5 h。
10. 4 ℃ ， 8000 rpm，离心20 min，弃上清。
11. 取1 mL PBS重悬沉淀，再8000 rpm，离心10 min，取上清。
12. 用移液枪轻轻移取出上清至另一支1.5mL的离心管，再往上清溶液中加入1/5体积（v/v）的PEG-NaCl溶液，且于4 ℃放置冰上进行冰浴，沉淀噬菌体大约3~5 h。
13. 4 ℃ ， 8000 rpm，离心10 min，弃上清。
14. 用200μL的PBS重悬沉淀，即获得所需的噬菌体扩增产物。

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噬菌体的滴度测定：
1.  取2×YT液体培养基，系列稀释噬菌体（10 µL），梯度稀释后，分别从三个梯度稀释的噬菌体中取出10 µL，并与200 μL的TG1新鲜菌液（OD=0.4)混匀。
2. 放置于37 ℃烘箱，静置15 min，用于噬菌体感染大肠杆菌TG1。
3. 将感染物用灭菌的涂布棒涂布于2×YT-A固体培养基上， 37 ℃，倒置培养过夜。
4. 次日选取菌落数在30~300的平板进行菌落计数，从而计算噬菌体滴度，且将洗脱噬菌体测定滴度的平板于4 ℃冰箱保存。

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噬菌粒的救援与纯化
1. 取已高压灭菌过的2×YT-AG培养基分装于多个1.5 mL离心管中，且每管体积均取0.9 mL。（可以换成深孔板）
2. 从每一轮洗脱物用于测定滴度的2×YT-A固体培养基上，分别随机挑取30~90个单菌落接种于分装好的0.9 mL 的2×YT-AG培养基中， 37 ℃， 220 rpm，振荡过夜培养。
3. 按照1%的接种量从上一步骤的培养液中取出少量培养物，重新接种于新鲜的0.9 mL的2×YT-AG培养基中， 37 ℃， 220 rpm，振荡培养3~5 h（直至OD600nm=0.35~0.5）
4. 按照1:1000的比例，向上一步骤中的培养物中加入辅助噬菌体M13K07，37 ℃，静置15 min，再放置于37 ℃摇床， 220 rpm，振荡培养30~45 min。
5. 4 ℃， 3000 g，离心10 min，弃上清。
6. 向上面每支1.5 mL离心管中再加入等体积的0.9 mL的2×YT-AK培养基，重悬沉淀。
7. 放置于30 ℃摇床， 220 rpm，振荡培养大约5~8 h。
8.  4 ℃， 8000 rpm，离心10 min，取上清。
9. 向上清中加入1/5体积的PEG-NaCl溶液，且于4 ℃放置冰上进行沉淀噬菌体，大约2~3 h。
10. 4 ℃， 8000 rpm，离心20 min，弃上清。
11. 用200 μL的PBS重悬沉淀，即得到纯度较高的经过救援的噬菌体，可用于进行Phage-ELISA鉴定。

（9-10步骤没必要做，8得到的上清即可进行phage-ELISA）

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Phage-ELISA 鉴定噬菌体阳性克隆
1. 将河弧菌菌液抗原包被酶标板， 100μL/孔， 4 ℃，包被过夜。
2. 0.05%的PBST洗板3次，用1%明胶封闭液进行封闭酶标孔， 300μL/孔， 37 ℃，封闭2 h。
3. 0.05%的PBST洗板3次，加入经PEG-NaCl纯化的噬菌体， 100 µL/孔， 37 ℃，孵育1 h。
4. 0.05%的PBST洗板4~5次，加入稀释了1:5000的HRP标记的抗M13二抗，37 ℃，孵育30~45 min。
5. 0.05%的PBST洗板4~5次，加入显色液100μL/孔， 37 ℃，显色8~10 min。
6. 加入2M的硫酸终止液， 50 μL/孔，终止反应，并立即用酶标仪测定其在450nm处的吸光值。