纳米抗体 2022 综述

青花瓷

01036
Camelid Single-Domain Antibodies: Promises and Challenges as Lifesaving Treatments
2022
2001年，Ablynx成立，定位于开发纳米治疗性抗体药物，经过20年的努力，研制出首款获得欧盟和FDA认证的用于治疗成人获得性罕见凝血障碍血栓性血小板减少性紫癜（TPP）的药物，从发现抗体分子到最终进入市场说明了该类药物治疗的新颖性，知识产权保护。
第一种sdAb药物的批准，加上关键专利的即将到期，会使得驼类纳米抗体出现打开新的视野，将成为未来几年的主流生物治疗药物。
这篇综述中，将为纳米抗体提供些批判性的观点，并对其作为诊断和治疗性试剂的广泛应用于提出了希望和挑战。

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This review is dedicated in memory of Professor Raymond Hamers, my mentor/PhD supervisor, a man with great vision and the father of camelid single-domain antibodies who passed away on 22 August 2021
纳米抗体发现者，Hamers 已经在2021.8.22日去世

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01036：
骆驼体内的抗体
哺乳动物体内的抗体相对保守，多为Y字结构。
人血清中的IgG最为常见，根据结构和功能的不同又分为4个亚型，其中IgG1最为常见。
重链形成四个区域，VH,CH1,CH2,CH3；轻链形成两个区域VL，CL。

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驼类或者羊驼血清中IgG通过蛋白A/G进行纯化。
(a) 2，4，6道分别代表不同类型的IgG；
1道: 蛋白Marker;
2道: IgG2 (Protein A分离纯化，非变性条件下电泳)
3道: IgG2 (变性条件下的电泳); 只有重链
4道: IgG1 (Protein A&G分离纯化，非变性条件下电泳) ;
5道: IgG1 (变性条件下电泳); 能看到轻重链
6道: IgG3 (Protein A&G分离纯化，非变性条件下电泳) ；
7道：IgG3 (变性条件下电泳);只有重链

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传统抗体的可变区采用保守的Ig折叠结构，由两个反向平行的β-折叠组成，其中紧密填充疏水氨基酸侧链，形成β-桶状或三明治状结构。IgG的c端区域(也称为可结晶片段或Fc)，包括CH2和CH3结构域，相对保守，发挥各种效应功能作用。
抗原结合的片段(Fab臂）包括两个可变域(VH和VL)和两个恒定区(CH1和CL)。
Fab臂通过铰链区域和Fc区进行分隔，不同类型的IgG交联区各不相同，这样就能允许Fab旋转至158°，Fab-Fab和Fab-Fc，分别产生115-172°和66-123°的夹角角度。

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过去几十年，当对几种不同哺乳动物的抗体进行深入分析Ig分子变异的结构、将遗传学和功能结合时，对抗体的传统看法发生了巨大变化。感兴趣的物种包括新旧世界的骆驼类:骆驼(阿拉伯骆驼)，C. ferus(野生双峰驼骆驼)，C. bactrianus(双峰驼)，Lama glama(美洲驼)，L. guanaco (guanaco)， Vicugna(vicugna)和V. pacos(羊驼)。
20世纪90年代，布鲁塞尔自由大学由Raymond Hamers教授领导的一个研究小组，从健康骆驼血清中观察到更小的缺乏轻链和重链CH1恒定区的IgG分子（90kDa)，后称为重链抗体。重链抗体在骆驼血清中占了血清中抗体75%的比例。
随后对其他骆驼物种(美洲驼和羊驼)也进行研究，也证实了重链抗体的存在，在这些物种中重链抗体在血清中IgG的占比较低(25-50%)。
进一步发现，通过放射免疫沉淀和印迹实验，从感染过伊万氏锥虫的单峰骆驼身上证实了重链抗体具有抗原结合活性。

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抗体基因序列分析发现了驼类重链抗体的独特性。
1994, 将驼类重链抗体的可变区命名为VHH，用于区分和传统抗体VH区。
发现在VH和VL进行结合的几个关键位点处，发生改变 V37F/Y, G44E, L45R, W47G。
通过对骆驼淋巴细胞进一步测序分析，得到能用于构建重链抗体库的通用引物序列。
构建了一个免疫骆驼的VHH噬菌体展示文库，用于筛选两种抗原，溶菌酶和破伤风类毒素的纳米抗体。
亲和力到纳摩尔水平，可溶性好，抗体分子不发生聚集。
浓缩的VHH抗体通过圆二色谱（197-215nm)检测，显示为IgG区β-片层结构。

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在骆驼类中发现hcab后，1995年格林伯格和他的同事在一种远亲护士鲨体内，适应性免疫系统中，也发现了名为IgNAR的重链免疫球蛋白，类似驼类重链抗体；
这些重链抗体有一个可变域，称为新抗原受体(vNAR)结构域，紧随的是5个恒定结构域。vNAR片段的免疫学和结构研究表明它们与骆驼的VHHs有相似的生物物理化学性质，比如体积更小，亲和性更高和特异度高，热稳定性好，生产成本低。这些抗体片段被认为是有希望的抗原结合域，有重要的医疗和生物技术应用价值。

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驼类纳米抗体的结构：
对VHH的apo晶体结构以及VHH-溶菌酶复合晶体结构显示了抗溶菌酶VHH的独特特征，如：
① CDR3区N端能垂直插入溶菌酶催化中心；
② CDR3区C端发生折叠覆盖在传统VL界面位置，屏蔽住VHH中一些残余的亲脂区（如PHE42）
这种抗体-抗原相互作用在之前的传统抗体研究中很难观察到，在人抗CDR1的经典结构发生了重要改变。
接下来的二十年里，结构研究进一步解锁了许多独特的VHH-抗原相互作用。
如：识别酶活性中心，蛋白表面空腔，识别蛋白质平坦的表面，以及VHH能形成凸起结构，以适应与小分子和半抗原的结合。

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为了更全面深入了解VHH和抗原的相互作用，对分辨率小于3A的105个VHH-抗原晶体结构进行结构研究，结果显示，VHH更倾向于识别刚性，凹型，保守和结构更为丰富的表位，这些表位富含芳香，极性，带电荷，疏水性氨基酸。
研究还发现，CDR3区参与50%的相互作用，而CDR2和CDR1对于相互作用分别贡献了20%和13%。
非CDR区在相互作用中参与了16%的作用，主要定位于VHH支架上的四个区域：即第一β链的N端，FR2区，C''和D环，DE环（即CDR4区）。VHH的抗体表位似乎充分利用了VHH:抗原相互作用云中每一个可接近的残基来增强亲和力。