TIM-3的纳米抗体

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T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3(T cell immunoglobulin and mucin-domain-containing molecule-3，TIM-3)作为T细胞抑制性免疫检查点，在肿瘤抗体治疗中具有独特的应用优势。
TIM-3是一类主要存在于全分化型分泌干扰素-y(IFN-y)的CD4 辅助性T 细胞1(Thelper cell 1，Th1)、CD8 细胞毒性T细胞(CTL)以及调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)、先天免疫细胞，树突细胞、自然杀伤细胞、单核细胞表面的特异标志物。
TIM-3是肿瘤免疫应答的负调控因子，可与肿瘤细胞表面的半乳糖凝集素-9、磷脂酰丝氨酸、高迁移率族蛋白B-1、癌胚抗原相关细胞粘附分子1等配体结合，进而减弱机体的抗肿瘤免疫应答。

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01030
TIM一3作为肿瘤抗体药物开发的靶点有两个优势：
一是TIM-3主要选择性表达于肿瘤浸润性T细胞中，因此，TIM-3作为治疗靶点，可以减少对正常组织和免疫效应分子的伤害；
二是TIM-3的胞内尾端并不包括任何免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine based inhibitory moti~ITIM)或免疫受体络氨酸转换基序(immunoreceptor tyrosinebased switch motif,ITSM)，这与包含ITIM／ITSM 的受体作用机制不尽相同，提示TIM-3将是其他包含ITIM／ITSM 的检查点受体（如PD1、CTLA-4)的绝佳合作靶点。

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TIM-3氨基酸序列：
常见的抗原表达截选22-200位
MFSHLPFDCVLLLLLLLLTRSSEVEYRAEVGQNAYLPCFYTPAAPGNLVPVCWGKGACPVFECGNVVLRTDERDVNYWTSRYWLNGDFRKGDVSLTIENVTLADSGIYCCRIQIPGIMNDEKFNLKLVIKPAKVTPAPTRQRDFTAAFPRMLTTRGHGPAETQTLGSLPDINLTQISTLANELRDSRLANDLRDSGATIRIGIYIGAGICAGLALALIFGALIFKWYSHSKEKIQNLSLISLANLPPSGLANAVAEGIRSEENIYTIEENVYEVEEPNEYYCYVSSRQQPSQPLGCRFAM

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免疫原蛋白：TIM-3-Fc融合蛋白
免疫2-3岁新疆双峰驼，每周一次，共免疫7次。
取血100ml，建库。
扩增后纳米抗体序列插入到噬菌体展示用载体pMECS中，电转TG1，构建针对TIM-3的噬菌体展示纳米抗体文库。
免疫文库库容约为10^9次方cfu。

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01030：
淘选，10ug/孔的TIM-3-Fc融合蛋白包被平板；
阴性对照使用Fc蛋白。
噬菌体库加入量为5×10^11cfu，室温反应1小时；
PBST×5清洗，三乙基胺洗脱噬菌体。
淘选3-4轮
经过三轮淘选后最终得到314倍富集的特异性噬菌体。

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Phage-ELISA
挑取1000个菌落进行鉴定，其中PE-ELISA阳性的有435个。共有29株序列不同的纳米抗体。
包被抗原用TIM-3-Fc蛋白，阴性孔用Fc蛋白
一抗为呈现后的噬菌粒上清液
再加入小鼠-抗HA标签抗体
二抗为碱性磷酸酶标记的山羊抗-小鼠免疫球蛋白G
再加入碱性磷酸酶显色底物。

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TIM-3纳米抗体的原核表达：
纳米抗体基因转化WK6菌株，在16°C下进行胞间质可溶性表达，采用Ni柱亲和层析纯化表达的重组蛋白。
纳米抗体在WK6菌中以可溶形式表达，表达量可以达到45mg/L以上。
质粒可以用pMECS系列或者pHEN4等

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构建TIM-3稳转细胞株：
TIM-3基因序列扩增后插入到pLVX-EF1α-puro载体，构建慢病毒质粒。
建立稳转细胞系。
制备TIM-3阳性抗体，用于稳转细胞系的鉴定。