人噬菌体抗体库的构建及人源性IL一17单链抗体的筛选

青花瓷

人噬菌体抗体库的构建及人源性IL一17单链抗体的筛选

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摘要：
目的：通过噬菌体展示技术构建人源单链抗体库，筛选抗IL-17的特异性抗体并鉴定。
方法：通过采集35位类风湿关节炎患者的外周血淋巴细胞，提取总RNA，逆转录合成cDNA，PCR扩增人H链和L链可变区抗体基因。利用SOE-PCR法将VH和VL片段拼接成ScFv片段并插入噬菌体载体pCANTAB5E中，构建人源噬菌体单链抗体库。通过固相化的抗原对抗体库进行3轮筛选后，挑取单克隆进行phage-ELISA鉴定，筛选与抗原具有较强结合性的噬菌体克隆。
结果：成功构建库容为3．5×10^8的噬菌体抗体库，从中筛选到5株阳性克隆，ELISA证实其对抗原IL-l7具有较强的结合性及中和活性。
结论：成功构建了人源噬菌体单链抗体库，从中获得具有抗IL-l7的人源ScFv抗体片段，为进一步的研究和应用提供实验基础。

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背景资料：
人白细胞介素-17(IL-17)是一种很强的促炎症细胞因子，可以通过增强促炎细胞因子释放来放大炎症反应。
在自身免疫病等疾病病理过程中发挥作用。
鼠模型及人类患者的研究中表明IL-17在类风湿关节炎发病机制中有重要作用。
在类风湿关节炎小鼠模型中，利用抗体中和IL-17后，可以明显的降低软骨、骨组织以及关节的损坏，另外治疗后IL-6水平也明显下降。
目前TNF-a拮抗剂是治疗类风湿关节炎的有效手段之一，但是其ACR50缓解率仍低于50％，且不良事件发生率较高。
本研究筛选IL-17的中和性抗体，针对类风湿关节炎治疗，同时用于对自身免疫病、移植排斥等疾病的治疗。

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主要实验材料：
噬菌体载体pCANTAB5E、辅助噬菌体M13K07、大肠杆菌TG1、抗M13单克隆抗体为Amersham公司产品。
IL-17蛋白及IL-17检测试剂盒购自R&D公司。IL-17蛋白序列参考GENBANK Q16552

Mtpgktslvslllllsleaivkagitiprnpgcpnsedknfprtvmvnlnihnrntntnpkrssdyynrstspwnlhrnedperypsviweakcrhlgcinadgnvdyhmnsvpiqqeilvlrrepphcpnsfrlekilvsvgctcvtpivhhva

红色字体部分Ile20-Ala155为商品化IL-17蛋白的氨基酸序列。

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研究对象

35例类风湿关节炎患者(RA组)外周血及20例健康体检者(对照组)血清

所收集的病例组均符合美国风湿病学会RA诊断标准，同时排除糖尿病、高血压、慢性系统性疾病及其他自身免疫性疾病。

收集的抗凝血液样本经离心分装，取少量利用双抗夹心法(ELISA)测定IL-17的含量。

RA组血清IL-17水平为47.29±4.21pg/ml

正常对照组血清IL-17水平为16.33±3.05pg/ml

两组相比，IL-17水平有统计学差异。

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轻重链基因的PCR扩增和全人源抗IL一17 ScFv抗体库的构建
从采集的35位类风湿关节炎患者血液中分离出淋巴细胞，用Trizol试剂提取淋巴细胞总RNA。
RT-PCR扩增抗体VH、λ 和K片段编码区。
以纯化的VH和VL为模板，经重叠PCR后合成ScFv片段。
ScFv采用的linker为(Gly4Ser)3，形成VL-(GGGGS)3-VH的基因片段，前后引入Sfi I和Not I酶切位点。和pCANTAB5E质粒连接后，经过4次电转TG1，构建ScFv抗体库，库容量为3.5*10^8M13K07辅助噬菌体进行感染，收集含噬菌体抗体的上清经过沉淀后获得噬菌体抗体库。