新型 CHO/ dhfr - 细胞定点整合和表达系统的建立

青花瓷

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摘要：
目的：建立CHO/ dhfr - 细胞的定点整合和表达系统。
方法：利用常规分子生物学方法，构建了一个新的高效筛选表达载体，该载体含有一个由FRT（fIp recombination target）位点、报告基因（LacZ）及筛选基因（zeocin）三片段构成的融合基因，而且该基因的表达受一个弱化的SV40 启动子的控制。借助于随机整合及高效筛选，实现FRT 位点在CHO/ dhfr - 细胞基因组中转录活跃区的整合，然后利用该位点介导的特异性重组实现了目的基因（单链抗体-尿激酶融合基因）的定点整合和有效表达，而且随后通过DHFR/ MTX 系统的加压扩增，以提高单链抗体-尿激酶融合基因在宿主细胞中的表达水平。
结果与结论：获得了能够实现外源基因在基因组中定点整合和有效表达的CHO/ dhfr - 细胞系，并利用该细胞系实现了单链抗体-尿激酶融合基因的高表达，表达量达到5ug（/ 10^6细胞·24 h）。

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背景摘要：
重组蛋白在哺乳动物细胞中表达水平的因素是多方面的：包括目的基因在基因组上的拷贝数，目的基因在基因组的整合位点，以及指导目的基因表达的启动子强度，表达产物的稳定性等。
商业化真核表达系统都针对这些因素进行了优化设计，如选用强启动子（CMV 或EF 启动子），带有加压扩增系统（DHFR 或GS）。
但是因为绝大多数真核表达载体都为随机整合载体，而随机整合所导致的位置效应决定了大部分克隆的表达水平较低；而且，在这些载体上，目的基因的表达与筛选基因的表达通常是分离的，也导致出现大量的假阳性克隆。
解决这些问题就需要有效地实现目的基因在基因组中转录活跃区（ 或称热点hot spot）的整合。
为实现此目的，目前主要有2 个思路
1. 通过弱化筛选基因表达及实现筛选基因与目的基因的表达偶联，从而提高目的基因在热点的整合概率。
2. 通过同源重组或位点特异性重组直接将外源基因整合到热点。
Invitrogen 公司已建立的一些哺乳动物细胞（包括293 细胞，BHK 细胞和正常的CHO 细胞等）的定点整合表达系统，但这些细胞的整合位点没有经过系统的优化筛选，而且不能很好地与常用的加压系统（如MTX 加压扩增系统等）配合，定点整合的外源基因的表达水平通常都较低，只能应用于实验室研究，而不能方便地用于建立适合中试生产的高表达细胞株。

本研究从优化真核表达载体着手，利用优化后的载体建立了在基因组中转录活跃区整合FRT 位点的CHO/ dhfr - 细胞株。随后利用FRT 位点介导的位点特异性重组实现目的基因（人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体-低分子量尿激酶融合基因，IIn-UK）在CHO/ dhfr - 细胞基因组中的定点整合和高表达。

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实验材料
CHO/ dhfr - 细胞株，ATCC 公司（CRL-9096）
质 粒 pFRT-laczeo和 pOG44，Invitrogen 公司的 Flp-In SyStem。
pFRT-laczeo 质粒含有 lacz-zeocin 融合蛋白的表达单元，用于筛选在基因组中合适位点整合有 FRT 位点的细胞株。
pOG44 含有 Flp 重组酶的表达单元，通过与特定质粒的共转染，可实现特定 质粒在基因组中 FRT 位点的定点整合。
质粒 pMCEa-IInUK 含有 2 个表达单元，其一为由 pCMV 启动的单链抗体-低分子量尿激酶融合基因（IIn-UK）表达单元，另一个表达单元为 pSV40 启动的 neo 基因的表达单元。

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质粒载体pFRT-laczeo 的改造
pFRT-laczeo 为Invitrogen 公司的一个商业化真核表达载体。质粒中启动lacz-zeocin 融合基因表达的为野生型SV40 启动子，转录活性相当强.
利用缺失增强子序列的SV40 启动子指导抗性基因表达时，能够大大减少低表达的背景克隆，从而更方便地筛选到在基因组中转录活跃区（ 或称热点）整合有FRT 位点的细胞株。
改造后的pFRT-laczeo3 与pFRT-laczeo 的区别在于：新质粒中指导lacz-zeocin 融合基因表达的为缺失部分增强子的SV40 启动子。

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Lacz 杂交探针的放射性同位素标记/适合外源基因定点整合的细胞株的筛选及鉴定
以质粒pFRT/ laczeo 为模板，扩增出453bp 的Lacz 探针利用TaKaRa 公司的随机引物标记试剂盒（Cat. #D6045）进行标记。质粒pFRT-laczeo3 进行线性化，转染CHO/dhfr-细胞，随后用zeocin 筛选。挑选31个阳性克隆，比较所有克隆的Lac Z的表达水平，挑选表达量较高的克隆提取基因组DNA，用HindIII进行完全消化，以同位素标记的Lacz 基因片段为探针进行Southern 印迹分析以确定pFRT-laczeo3 质粒在基因组中的拷贝数，并最终筛选到整合了单拷贝的pFRT-laczeo3 的细胞株。

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IIn-UK 融合基因在CHO/ dhfr - 细胞基因组中的定点整合和高表达
IIn 为本室经过体外亲和力成熟而获得的l 株对人纤维蛋白特异的人源化鼠单链抗体，抗人纤维蛋白单链抗体-尿激酶杂合体具有较好的体内导向溶栓效果，有望开发成为新型导向溶栓药物。
为实现该IIn-UK 融合基因在CHO/ dhfr - 细胞中的定点整合和表达，构建新质粒pMCEfrt-IInUk，和pOG44 共转染细胞株CHOfrt / dhfr - 。
发生定点整合后，原基因组中的lacZ-zeocin 表达单元将被灭活，而表达新整合的neo 基因（即表现为G4l8 抗性）利用G4l8 筛选，然后随机挑取5 个阳性克隆进行分析，结果表明这些克隆都表现为zeocin 敏感，不表达lacZ 基因，表达IIn-UK 融合蛋白（ 图3）。

用溶圈法对尿激酶活性进行分析，结果表明这些克隆具有相似的尿激酶表达水平（图4），且表达量接近0.5ug（10^6细胞·24 h）。表明IIn-UK 融合基因已在CHO/ dhfr - 基因组中的FRT 位点定点整合并获得有效表达。

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在IIn-UK 融合基因的下游偶联表达DHFR 基因，通过两轮MTX 的加压，获得多株表达量达到5 ug（/ 10^6细胞·24 h）的细胞株。
该新型定点整合表达系统能够有效实现定点整合于基因组中FRT 位点的外源基因的扩增和高表达。

实现重组蛋白在哺乳动物细胞中高表达存在研制周期长，综合成本高等问题。这主要是由于筛选高表达细胞株是一个既费时又费力的过程。因而研制高效、经济的真核表达系统一直是生物工程技术领域、尤其是蛋白制药领域的一个主要发展方向。


本研究建立的基于flp-FRT 重组系统的CHO/ dhfr - 细胞定点整合和表达系统，能够方便、快速地实现外源基因在CHO / dhfr - 基因组中转录活跃区的定点整合和有效表达，而且通过MTX 加压，能够有效提高目的基因的表达水平。