HIV,HCV和HBV核酸检测技术及策略 在血筛应用中的研究进展

青花瓷

HIV,HCV和HBV核酸检测技术及策略 在血筛应用中的研究进展 读文献笔记

青花瓷

血液筛查方法包括：

血液安全问题被WHO列为全球卫生七项重点工作之一。

HCV，HBV，HIV是输血性传播疾病的主要病原体，2012年止，全球HIV感染者人数达到3330万，HBV感染者人数达到20亿，HCV感染者人数达到1.7亿人，我国HBV人群携带率达到10%，HCV感染率是3.2%。

抗原和/或抗体的酶联免疫吸附实验ELISA，血清学检测SS，核酸检测NAT。

方法在不断改进，精确度和灵敏度不断升高。

新型方法包括：聚合酶链反应-酶联免疫吸附（PCR-ELISA）,基于纳米材料的微流控技术对病原体多元快速检测。

青花瓷

血清学检测：

①   蛋白印迹是确认HIV感染的金标准，但是无法应用于HIV的筛查。酶联免疫吸附试验成为HIV筛查的标准方法，我国在血筛中以第3代双抗原夹心ELISA进行HIV抗体检测，欧美国家用第四代产品进行P24抗原与抗体的检测。

②   HBV筛查包括快速HbsAg检测和ELISA复核检测，但窗口期和隐性HBV感染仍可导致HBV的输血传播。HBV筛查包括快速HBsAg检测和ELISA复核检测，窗口期和隐性HBV感染仍可导致HBV的输血传播。HBcAb的筛查可以提示隐性HBV感染，但是假阳性率太高。

③   目前，抗-HCVELISA假阳性问题比较突出，HCV ELISA等商业化试剂在HCV流行率<ｌ０％的各类人群中，检测结果假阳性率平均为35％。由于HCV核心抗原在外周血中远早于抗体出现（7-8周），几乎与RNA出现时间一致。同时，部分血液透析的患者和免疫缺陷的患者在感染ＨＣＶ后并不出现ＨＣＶ抗体。所以HCV核心抗原检测方法逐渐发展。

青花瓷

核酸检测：

血清学检测HBV、HCV、HIV的“窗口期”分别长达59,70,16天，是影响血液安全的主要因素，病毒滴度、病毒变异和隐性感染等因素也可导致漏检。目前应用于血液筛查的核酸检测方法主要基于聚合酶链反应PCR技术和转录介导的扩增TMA技术。

PCR包括反转录PCR、巢式PCR、定量PCR、多重PCR以及PCR酶标技术、PCR寡核酸探针杂交技术、荧光PCR和免疫PCR多种实用技术。

TMA包括转录介导的扩增系统（Transcription mediated amplification TMA）和核酸序列依赖扩增系统（Nucleic acids sequence based amplification NASBA）。

青花瓷

TMA：

利用反转录酶和RNA多聚酶在等温条件下扩增核糖核酸（RNA）或脱氧核糖核酸（DNA）。NASBA的原理与TMA相似，只是在核酸提取和扩增产物检测的方法上有所不同。这两种方法的特异性强，灵敏度高，反应条件简单，扩增效率高，无需专门的扩增仪器，且因整个反应在１个试管中进行，也减少了污染。

目前，世界范围内血液筛查中主要利用少量样本汇集的三重核酸检测（MP-NAT）模式，通过提取和扩增血液中的总核酸同时检测血液中HBV DNA，HCV/HIV RNA，　部分国家和地区采用单人份三重核酸检测模式（ID-NAT）或６人份样本汇集核酸检测（MP-6-NAT）。

由于用三重MP-NAT依然存在漏检，在HBV高流行区应尽量减少汇集样本的份数，甚至采用单人份检测。

虽然HCV基因组呈现极端的多样化，但５’非编码区(UTR)在不同HCV亚型间高度保守，是多数HCV RNA检测的靶区域。然而一些研究证实，HCV的５’UTR仍存在核酸突变和多态性。因此，目前普遍应用的单引物/探针模式可能会因为错配而产生漏检。而目前研究较多的多重引物/探针检测技术能同时扩增检测多个靶序列，显著提高检测性能而不影响特异性，能够检测出单引物/探针方法易漏检的不同基因型突变株样本及一些低病毒载量样本。

目前血筛中应用三重MP-NAT方法检测HIV gag、env、pol或LTR。而HIV基因组的高度变异性可影响到引物和探针区域，可导致引物不能引导特殊变异株进行有效PCR扩增。为此，同时检测env和LTR的双目标NAT可有效处理因基因多态性导致的假阴性结果。如COBAS Taqman HIV test version2.0（Roche诊断）。但多目标扩增检测存在较高的非特异性反应，检测目标浓度较低时易出现假阳性。

青花瓷

不同的背景采用不同的检测策略：

① 基于病理生理互补的筛查策略　由于病原体在外周血中存在间歇性现象，而抗体则持续存在，这对确保用血安全有着重要的意义。因此，NAT和ELISA两者结合更能保证血源的安全。在HBV低流行区采用ID-NAT取代HBV血清学检测的策略。而在埃及等HBV高流行地区，不能用ID-NAT取代血清学检测。各个国家和地区应根据当地疾病流行特点制定适宜的血液筛检策略。

② 基于特殊检测条件互补的筛查策略　一方面，OBI感染者多为高龄献血者，NAT检测病原体的核酸与机体的免疫状况无关，不受隐性感染的影响。另一方面，一些药物如干扰素、拉米夫定等其药理基础都是抑制病毒核酸合成，这部分患者会出现NAT转阴而抗体阳性的现象。在此情况下应用NAT的筛查策略收益减低。因此，配合献血前的筛查程序，合理搭配血清学检测和核酸检测的应用策略，可以取得最佳的筛查效果。

③ 基于经济效益比的筛查策略　在不同国家/地区对是否引入NAT的态度不同。在美国进行的一项大规模关于不同筛查策略经济效益比的研究显示，在美国当前条件下（血清学检测HIV P24、HBsAg、抗HIV1+2、抗-HCV、抗-HBc；三重MP-16-NAT），与单独应用SS相比，Ｓ+MP16-NAT-P24血液筛查策略的增量成本效益比为＄1.5百万／质量调整寿命年；低于SS+ID-NAT-P24、SS+ID-NAT-P24/HBcAb和SS+ID-NAT-P24/HBsAg筛查策略（分别为＄7.3，5.0，1433百万／质量调整寿命年)而且随着疾病流行率的下降，增益经济效益比将进一步升高。目前，理论上合理的健康干预的增益经济效益比阈值为＄50000～100000／质量调整寿命年。通过社会学调查发现，虽然SS+NAT策略的增益成本效益比高于＄１百万／质量调整寿命年的付出意愿值。但是，人们仍愿意采用进一步提高用血安全的措施。政策制定者应视具体收益和投入情况制定合理的血液筛查策略。