鼠源E型肉毒毒素免疫噬菌体单链抗体库的构建及筛选

青花瓷

鼠源E型肉毒毒素免疫噬菌体单链抗体库的构建及筛选

青花瓷

摘要
目的： 构建鼠源E型肉毒毒素免疫噬菌体单链抗体库， 筛选特异性抗体。
方法：E型肉毒类毒素免疫小鼠，建scFv噬菌体抗体库； 用纯化的BoNT/E进行3轮富集筛选。
结果： 鼠源免疫噬菌体单链抗体库的库容为7.09×10^7， 3轮筛选， 噬菌体抗体富集了66倍，序列比对得到不同的特异性抗体。
结论：构建了库容量达7.09×10^7的鼠源免疫噬菌体单链抗体库， 筛选得到了24个不同序列的特异性抗体。

青花瓷

实验用材料：
TG1：stratgene公司
E型肉毒类毒素：浓度为275ug/ML，结合力900BU/ml
BONT/E重组蛋白：纯度为85%，浓度为240ug/ML
噬粒pS100
免疫动物：Balb/C小鼠

青花瓷

小鼠免疫2天后，尾静脉取血， 间接ELISA测血清效价，筛选到3只1：100000的小鼠，取脾，脾细胞能达到1.4-3.6×10^8。脾细胞中提取mRNA，反转录成cDNA。

青花瓷

第一轮PCR合成引物共26条。
12条VH上游引物，1条VH下游引物
10条Vk上游引物，1条Vk下游引物
1条Vλ上游引物，1条Vλ下游引物
上游引物设计在FR1区，下游引物设计在CH/CL区，均不含酶切位点和连接肽序列。

青花瓷

第二轮PCR合成引物共31条。
12条VH上游引物，4条VH下游引物
10条Vk上游引物，3条Vk下游引物
1条Vλ上游引物，1条Vλ下游引物
上游引物设计在FR1区即V片段，下游引物设计在FR4区即J片段
VH上游引物和VL下游引物各有一个Sfi I酶切位点。
VH下游引物和VL上游引物有一段可重叠的连接肽序列。通过重叠延伸PCR可以获得ScFv片段。
H链和K链，H链和λ进行融合。

青花瓷

质粒的构建和鼠源BoNT/E免疫噬菌体单链抗体初级库的制备
pS100噬粒和ScFv片段用Sfi I酶切，回收后进行连接。
电转TG1感受态。
梯度稀释后涂2YT-AG培养皿（含氨苄西林，葡萄糖），用以计算库容容。
随机挑选克隆测序验证抗体库多样性。
其余菌液继续涂布2YT-AG培养皿，培养过夜后用含15%甘油的2-YT液体培养基收集菌体。
进行40次电转化，收集所有菌体作为初级噬菌体抗体库。
随机挑选20个克隆测序验证抗体库多样性。数据和VBASE2数据库进行比对。

pS100-VH+K转化效率为3.6×10^7/ug
pS100-VH+λ转化效率为3.193×10^7/ug
载体自连效率为2×10^5/ug，自身连接背景较低，不影响库容。
pS100-VH+K亚库和pS100-VH+λ亚库按19：1进行合并，最终得该抗体库库容为7.09×10^7

青花瓷

噬菌体拯救法构建噬菌体抗体库
标准操作流程可见"辅助噬菌体的制备”

青花瓷

单链抗体初级库抗体基因序列分析
随机挑取20个scFv克隆测序，结果表明20个序列各不相同，具有良好的多样性。
17个scFv序列翻译完全正确，正确率达85％，其中14个VH+K、3个VH+λ。
因为鼠源抗体轻链κ占95％，λ只占5％。
所以针对λ轻链只设计了1条引物，测序结果显示IgLV只有一个家族即IgLV1。

青花瓷

肉毒毒素是由肉毒梭菌产生的一种细菌外毒素。根据抗原性的不同， 肉毒毒素分为共有A-G 7个血清型， 其中A、B、E和极少数F型主要引发以人迟缓性神经麻痹为特征的肉毒中毒。
肉毒毒素是目前已知的毒性最强的生物毒素。